Корзина
+375
29
652-38-87
+375
33
904-47-27
+375
25
743-99-18
БеларусьМинск
Корзина
MedBooks
  • MedBooks
  • Статьи
  • ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА С ОСНОВАМИ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА С ОСНОВАМИ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА С ОСНОВАМИ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

Цитогенетическое исследование включает следующие основные стадии: – получение препаратов метафазных хро- мосом из лимфоцитов периферической крови; – окрашивание препаратов; – микроскопический анализ и обработка результатов

Для получения препаратов хромосом в за-
ранее приготовленные стерильные пробирки с
гепарином вносят 5–6 мл крови и закрывают
стерильной пробкой. Для постановки культуры
обычно используют цельную кровь, можно
также использовать плазму, обогащенную лей-
коцитами. В соответствующих пособиях и ру-
ководствах методы цитогенетических исследо-
ваний описаны достаточно подробно, отметим
лишь общую схему.
Полученную кровь (0,5 мл на 4,5 мл культу-
ральной смеси) культивируют в термостате при
температуре 37 °С. Культуральная смесь состо-
ит из питательной среды (типа RPMI-1640,
Игла или 199) с добавлением 15–17% сыворот-
ки (крупного рогатого скота, телячьей или эм-
бриональной телячьей), 2 мМ глутаминовой
ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ
166 Приложение
кислоты и антибактериальных препаратов (бензилпенициллин
100 МЕ/мл, стрептомицин 0,1 мкг/мл). В норме лимфоциты прак-
тически не делятся, т.е. находятся в стадии G0 клеточного цикла.
Для того чтобы перевести их в стадию G1, в культуральную смесь
необходимо добавить фитогемагглютинин, стимулирующий про-
цесс деления. Интерфазные хромосомы невозможно наблюдать в
обычный световой микроскоп, а вот в митозе при делении благода-
ря высокой степени компактизации хромосомы становятся види-
мыми. Для накопления клеток на стадии метафазы митоза исполь-
зуют ингибиторы образования веретена деления — колхицин или
колцемид.
По окончании инкубации проводят фиксацию смесью метанола и
ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, но перед фиксацией
клетки выдерживают в гипотоническом растворе калия хлорида
(0,56%); время гипотонической обработки должно составлять 20–
25 мин. После нескольких смен фиксатора клеточный осадок приоб-
ретает белый цвет. При последней промывке удаляют супернатант,
оставляя примерно 0,25–0,5 мл клеточной суспензии.
Одним из условий для получения качественных препаратов хро-
мосом является подготовка предметных стекол. Поверхность стекла
должна быть идеально чистой. Клетки тщательно ресуспендируют в
оставшемся фиксаторе с помощью пастеровской пипетки, клеточ-
ную суспензию наносят на предметное стекло и высушивают его.
Время культивирования зависит от поставленной задачи. Так,
при анализе кариотипа оно составляет 72 ч. Это время соответству-
ет наступлению второго митоза, когда число клеток удваивается.
При использовании цитогенетического метода для целей биодози-
метрии (об этом ниже) необходимо анализировать клетки, прохо-
дящие первое деление. В этом случае время культивирования со-
ставляет около 50 ч и варьирует в незначительных пределах для
каждой лаборатории; кроме того, существуют индивидуальные ко-
лебания.
При рутинном (стандартном) окрашивании красителем Романов-
ского–Гимза все хромосомы окрашены равномерно. В этом случае
можно определить числовые мутации и такие перестройки, как ди-
центрики, парные и одиночные фрагменты, центрические и ацен-
трические кольца, хроматидные аберрации. Опытный цитогенетик
может обнаружить и аномальные хромосомы, возникшие в результа-
те инверсии или симметричной транслокации (рис. 1).
167
Лабораторные методы диагностики наследственных болезней
Рис. 1. Рутинное окрашивание хромосом
Для более детального анализа применяют дифференциальные ме-
тоды окрашивания. Каждая хромосома имеет присущие лишь ей не
только длину и соотношение плеч, но и уникальное чередование
участков эухроматина и гетерохроматина. Благодаря этому после спе-
циальной обработки полосы (бэнды) окрашиваются в разные цвета;
окраска хромосомы напоминает штрихкод. Таким образом, стано-
вится возможным выявить весь спектр хромосомных аберраций в
пределах разрешения, определяемого шириной полос (рис. 2).
Рис. 2. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-banding)
168 Приложение
Во время культивирования в культуральную смесь можно доба-
вить избыточное количество бромдезоксиуридина (БУДР — аналог
тимидина). БУДР будет встраиваться во вновь синтезируемые цепи
ДНК, и, соответственно, в каждой хромосоме клеток второго митоза
в одной из хроматид обе нити двунитевой молекулы ДНК будут со-
держать только БУДР вместо тимидина, а в другой — только одна из
них, а другая, послужившая исходной матрицей, будет содержать ти-
мидин. После окрашивания одна из них приобретет светлую окра-
ску, а другая — темную (так называемые арлекиновые хромосомы).
Этот метод позволяет увидеть обмены между сестринскими хромати-
дами (СХО — сестринские хроматидные обмены).
Хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови
можно рассматривать как индикатор мутагенного воздействия. Су-
ществуют некоторые особенности. Так, при химическом мутагенезе
чаще образуются сестринские хроматидные обмены и аберрации
хроматидного типа; для радиационного мутагенеза характерны абер-
рации хромосомного типа. Важно отметить, что частота хромосом-
ных нарушений существенно повышена у курильщиков.
Существует количественная зависимость между частотой хромо-
сомных аберраций и дозой облучения; кроме того, кривые доза-
эффект, полученные при облучении in vivo (данные наблюдений за
пациентами, прошедшими курс радиотерапии, за профессионала-
ми, подвергающимися радиационному воздействию в ходе профес-
сиональной деятельности либо вследствие радиационных аварий) и
in vitro (эксперименты с клеточными культурами) совпадают. Эти
два обстоятельства сделали возможным использовать частоту хро-
мосомных аберраций (дицентриков и колец) для целей биологиче-
ской дозиметрии. Кровь циркулирует по всему организму, и при об-
лучении любой части тела лимфоциты подвергнутся воздействию.
Оказалось возможным заранее в лаборатории получить градуиро-
вочную кривую доза-эффект для частоты аберраций хромосом
определенного типа, характерного для радиационного воздействия,
а потом использовать ее для количественного определения дозы об-
лучения пострадавших. Важно и то, что автоматически учитывают-
ся различия в радиочувствительности клеток людей (рис. 3. Прило-
жение, см. цв. вклейку).
Помимо лимфоцитов для проведения цитогенетического анализа
могут использоваться и другие ткани, например, костный мозг, фи-
бробласты кожи; при проведении пренатальной диагностики прово-
169
Лабораторные методы диагностики наследственных болезней
дят цитогенетическое исследование хориона, в онкологии объектом
исследования служат опухолевые клетки.
В последние годы все более широкое распространение приобре-
тает метод, который можно назвать молекулярно-цитогенетическим.
Речь идет о флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ
hybridization); по первым буквам метод получил название FISH. Ме-
тод FISH основан на способности хромосомной ДНК (ДНК-мишень)
связываться в определенных условиях с фрагментами меченной ДНК
(ДНК-зонд), включающими нуклеотидные последовательности,
комплементарные ДНК-мишени.
Предметные стекла с метафазами обрабатывают таким образом,
чтобы произошла денатурация (расхождение нитей двойной спира-
ли) ДНК. Затем на стекло наносят в избыточном количестве заранее
приготовленные пробы — комплементарные последовательности
ДНК, содержащие флуоресцентную метку, которые взаимодействуют
с однонитевыми структурами, образуя хроматиды, одна нить которых
состоит из меченой ДНК, а другая — «обычная» (исходная). После
окрашивания флуоресцентным красителем меченая хромосома отли-
чается по окраске от остальных. Анализ производится с использова-
нием флуоресцентного микроскопа со специальными фильт рами.
Особая практическая значимость FISH-метода связана с возмож-
ностью детекции меток не только на метафазных пластинках, но и в
интерфазных клетках. Это существенно расширяет границы его при-
менения.
Метки могут быть специфичны и соединяться либо с целыми хро-
мосомами, либо с их фрагментами; существуют специальные метки,
соответствующие центромерам. Зонды, используемые в FISH-
методе, подразделяют на:
– CEP — Chromosove Enumerator Probe, хромосомные нуменато-
ры или центромерные зонды;
– LSI — Locus Specific Identificator, локус специфические зонды;
– SubTel — Subtelomere specific, субтеломерные зонды;
– WCP — Whole-Chromosome-Painting, зонды полного окраши-
вания хромосом, цельно-хромосомный зонд.
Если метки соответствуют целой хромосоме, при цитогенетиче-
ском анализе быстро и несложно будет установить наличие этой хро-
мосомы в кариотипе, а также увидеть, участвует ли она в транслока-
циях или других перестройках, затрагивающих и другие хромосомы.
Так, при проведении пренатальной диагностики возможно с большой
Предыдущие статьи